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繳交的時間是12/30星期五下午1點前
星期四78節可交到系統生物學教室
星期五12:00~13:00我應該會在1A01教室收大家的報告
謝謝各位<(__)>
by淑嫻
實驗十 化膿性球菌(Pyogenic Coccus)
一、 目的
鑑別Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus (Streptococcus pneumoniae)
等化膿性球菌。
二、 實驗材料
1. 菌種
(1) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Sra
(2) 白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)Ac
(3) 檸檬色葡萄球菌(Staphylococcus citrus)Ci
(4) α溶血性鏈球菌(α-hemolytic Streptococci)
(5) β溶血性鏈球菌(β-hemolytic Streptococci)
2. 一片營養培養基平盤
3. 3%過氧化氫(H2O2)溶液
4. 載玻片一片
5. 木蜜醇固體培養基(mannitol solid agar)
6. 羊血漿
7. 無菌培養皿
8. 血液培養基平盤(blood agar plate)
9. 鑷子、接種環、接種針
三、 實驗步驟
1. 觸酶實驗(Catalase test)
(1) 於載玻片上以簽字筆劃分成二區，並標明A、B。
(2) 以接種環行無菌操作，各挑取適量的Staphylococcus菌屬、Streptococcus菌屬二菌種
，塗抹於載玻片上的A、B二區。
(3) 二區各滴1~2滴的3%過氧化氫溶液。
(4) 靜置數分鐘後觀察結果，不同菌屬是否有差異的結果。
2. 木蜜醇發酵實驗(Mannitol fermentation test)：將沾有三種不同Staphylococcus的
接種針，分別種入含有溴甲酚紫(bromocresol purple)指示劑和mannitol的平盤培養
基中，置於37℃培養，經24小時後觀察。
3. 色素形成試驗(Pigment formation test)：將三種不同Staphylococcus接種於營養培
養基平盤上，於37℃培養48~72小時後觀察之。
4. 鏈球菌的溶血作用(Hemolytic reaction)：將Streptococcus接種於血液培養基平盤，
至於37℃培養箱中，隔天觀察之。
四、 原理
(一) Staphylococcus的鑑別
Staphylococcus的種類眾多，其中有些具致病性，例如Staphylococcus aureus，
有些則較不具致病性，例如：Staphylococcus albus及Staphylococcus citrus。
Staphylococcus albus屬於表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，其致病性
小，但量多時亦會致病。
這些不同種類的Staphylococcus可以利用下列幾種試驗檢測其特性：
1. Catalase test：主要用來鑑別Staphylococcus和Streptococcus (Staphylococcus
含有catalase)。
(1) 原理：具有catalase的細菌會催化H2O2'O2+H2O反應進行，且反應為''立即''反應。
(2) 方法：用接種環挑取菌種，至於玻片的H2O2中。若用slant培養菌，可直接滴H2O2於
slant上。
(3) 結果：A產生氣泡O2為陽性，故可推測A中加入的細菌為Staphylococcus，B沒有產生
氣泡O2。
(4) 注意：Streptococcus需要血才會長得好，一般培養在blood agar (5% sheep blood)
中，需輕刮其上的細菌，勿刮到blood agar，否則會因血球也具catalase而
產生偽陽性的反應結果。
2. Mannitol fermentation test：可區分出3種Staphylococcus，因為其致病力差很多。
(1) 原理：Staphylococcus aureus會分解mannitol，而使指示劑例如bromocresol purple
由中性的紫色變成酸性的黃色，或phenol red由紅色變成黃色。
(2) 方法：將沾有三種Staphylococcus的3支接種環，分別塗抹於含有phenol red和
mannitol的培養基三區域中，經37℃培養24小時後觀察。
(3) 結果：只有含有Staphylococcus aureus的區域周圍變成黃色，另兩菌的顏色沒有變化。
3. Pigment formation test：色素是最早用來區分細菌的方法，所以細菌的學名中才
有aureus, albus, citrus等字，但由於有些細菌會變種，所以現在多用其他方法區分。
(1) 原理：因為色素為脂溶性物質，不會溶於培養基中，所以會出現在細菌本身的菌落中。
(2) 方法：在培養皿上劃分成3個區域，再接種細菌(aureus, albus, citrus)即可。
(3) 結果：於25℃培養48~72小時後，可見到Staphylococcus aureus呈金黃色，
Staphylococcus albus呈白色，Staphylococcus citrus呈檸檬黃色。
(二) Streptococcus的鑑別
Streptococcus的形態特徵為短鏈球狀或長鏈球狀，根據在blood agar上的溶血作用，
又被分為alpha、beta、gamma等溶血特性。
4. Hemolytic reaction：可用來區分alpha, beta, gamma-hemolysis三種
Streptococcus的細菌。
(1) Alpha(α)：不完全(incomplete)溶血，菌落周圍為一圈草綠色。
(2) Beta(β)：完全(complete)溶血，菌落周圍可見一圈透明的溶血圈。
(3) Gamma(γ)：完全不溶血(nonhemolytic)，菌落周圍沒有改變。
5. Bacitracin sensitivity test：用來區分出β-group A Streptococcus。
(1) 原理：利用β-group A Streptococcus會對bacitracin(枯草桿菌素)有感受性，
而區分出來。
(2) 方法：將枯草桿菌素貼在塗滿細菌的培養皿中。
(3) 結果：枯草桿菌素周圍出現了抑制圈，故可知此菌β-group A Streptococcus。
結果紀錄
1.請將三種葡萄球菌的分析結果說明並比較。
2.請將三種鏈球菌的分析結果說明並比較。
問題討論
1.利用鏡檢以菌落觀察法是否可區分出葡萄球菌與鏈球菌?如果不行，應該再做何種試驗?
2.簡述鏈球菌的溶血情形及其特徵。
3.血液培養基平盤該如何製備?在何種情況下須使用之?目的為何?
4.實驗室欲鑑定出肺炎鏈球菌，常使用何種試驗?
實驗十一 腸內桿菌科(Enterobacteriaceae)
腸內桿菌科(Enterobacteriaceae)的細菌是人類或動物腸道內主要的菌叢，皆為革蘭
氏陰性菌，包括大腸桿菌(Escherichia coli)、產氣桿菌屬(Enterobacter spp.)、變形
桿菌屬(Proteus spp.)、沙門氏桿菌屬(Salmonella spp.)、志賀氏菌屬(Shigella spp.)
等細菌。腸內菌分離最大的特性是同時採用多種培養基，利用不同菌種之間生化特性的差
異，作逐步分離、篩選和鑑定。
一、目的與原理
將檢體接種在含有特殊成分的培養基上，如EMB、SS等，觀察不同腸內桿菌在不同培
養基的生長情形，可做為初步分離的根據。將初步分離的菌落接種在特定設計的各種生
化培養基內(如IMViC試驗)，可依其表現的不同生化特性鑑定菌群和菌種。
二、實驗材料
(一) 細菌的培養與檢品
培養24小時的大腸桿菌(Escherichia coli, E)、產氣桿菌(Enterobacter aerogenes,
EA)、變形桿菌(Proteus vulgaris, PV)、沙門氏桿菌(Salmonella paratyphi B, Sal)、
志賀氏菌(Shigella dysenteria, Shi)培養基。
1. Eosin-methylene blue (EMB)平盤1個
2. Urea agar平盤2個
3. Nutrient agar平盤1個
4. Triple-sugar iron (TSI)半斜面培養基4支
(二) 儀器
酒精燈、接種環(loop)、接種針(needle)、滴管。
三、實驗步驟
一般常用含有生化特性的鑑定培養基及方法如下：
1. 含有碳水化合物(carbohydrate)培養基：可鑑定菌種是否會分解發酵碳水化合物如葡
萄糖、乳糖等，若會發酵則會產生酸或氣體，此時培養基內的指示劑酸鹼度改變可使菌
落的顏色改變，作為鑑定的依據。Eosin-methylene blue(EBM)培養基的指示劑為eosin
Y和methylene blue，其酸性時為紫黑色，pH 4.5以下會形成中心黑色、有綠色金屬光
澤的大菌落。
2. Triple-Sugar Iron (TSI)培養基：最常做為鑑定腸內桿菌多樣性變化的培養基。主
要是依據細菌發酵醣類的結果、是否產氣和產生硫化氫等三者情形作為比對的參考。
(1) K/K整支顏色不變(維持紅色)
(2) A/AG(+)整支顏色變黃色，並有氣體產生。
(3) A/AG(-)整支顏色變黃色，沒有氣體產生。
(4) K/AG(+)H2S(+)試管下端變黃色，但斜面三角頂端為紅色，並有氣體產生。若有
黑色沉澱物產生，為FeS產物。
3. 尿素水解作用試驗
(1)材料
A.接種環、酒精燈。
B. Medium：尿素培養基(urea agar)
C.菌種：Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris,
Salmonella paratyphi B, Shigella dysenteria。
(2)步驟
A.將不同菌種接種於尿素培養基
B.置於37℃、培養2~16小時。
C.觀察結果
(3)結果：記錄培養基之顏色變化，呈現粉紅色表示陽性反應。
結果紀錄
1.請照相或繪圖說明各菌種 TSI agar呈現的結果。
2.請說明測試菌種在IMViC agar的結果。
問題討論
1.請嘗試說明目前在醫學中心如何檢驗腸內桿菌科的細菌?
2.請舉出腸內桿菌科屬於法定傳染病的病原體有哪些?
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※ 編輯: shwang 來自: 125.233.151.55 (12/28 21:53)
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I M V C
E coli + + - -
Ea - - + + 不過我們沒做這四個實驗 我不知道要不要寫~~
※ 編輯: shwang 來自: 125.233.145.185 (12/29 22:15)
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