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恩我想請問一下做蛋白質定量的時候使用Bradford method 其中Dye 的多寡會影響到OD值嗎? 其實是我有同學最近在做這個實驗方法是10ul的BSA + 190ul 的Dye 然後同時做兩組 ... ... <看更多>
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引述《pent (情人去死)》之銘言： : 抱歉，問個笨問題: bradford assay測濃度，BSA建standard curve : duplicate,96-well plate : sample 10ul+ 190 ... ... <看更多>
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※ 引述《pent (情人去死)》之銘言：
: 抱歉，問個笨問題
: bradford assay測濃度，BSA建standard curve
: duplicate,96-well plate
: sample 10ul+ 190 bradford reagent
: reagent 5倍稀釋
: (mg/ml)
: sample OD1 OD2 average
: 1 1.0329 1.0275 1.0302
: 0.5 0.7091 0.714 0.71155
: 0.25 0.3947 0.439 0.41685
: 0.125 0.209 0.2159 0.21245
: 0.0625 0.0833 0.0659 0.0746
^^^^^^^^^^
你都是2倍稀釋，中間應該穿插個其他質數倍數的稀釋，像是3倍或5倍
: Blank 0.0034 -0.0034
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
Blank是什麼？空的還是有加buffer？
目前我做過的實驗吸光值是沒有負值的，所以我也採用
基本上我會建議Blank要放等體積的Buffer去和Bradford混合
而非單純只加Bradford，甚至是什麼都不加
以你的實驗而言就是10uL sample buffer + 190uL Bradford
我幫你利用你的數值重新算過一次
看圖的感覺是濃度1已經飽和了
這也是Bradford常有的問題，濃度1對他而言濃度太高，會低估
所以我將濃度1的這個點去除不拿來作為曲線的參考值
結果為：y = 1.4199x + 0.0211 R平方=0.9849
: 100倍稀釋
: sample average conc.
: IP 0.0134 0.0118 0.0126 -7.136746
: before 0.0326 0.035 0.0338 -5.095398
: A 0.101 0.1 0.1005 1.327145
: B 0.0675 0.0707 0.0691 -1.696361
: 趨勢線的公式：y=0.9629x-0.0835 r square>0.95
^^^^^^^^^^^^^
第一點，也是很重要的一個基礎點，r平方值要大於0.99
其實你的技術還不差但還需要再以加熟練
但因為你的1/4跟1/16的二重覆相差頗大
我以人工選擇的方式利用以下數據作曲線
Standard OD1 OD2 AV
1/2 0.71155
1/4 0.3947
1/8 0.21245
1/16 0.0833
得到結果為：y = 1.4035x + 0.0216 R平方=0.9931
雖然得到漂亮的數值，但是參考的點數太少，基本上還是建議你重做
這個人工篩選是很不得已的情況才做，畢竟是一個很主觀的作法
不符合實驗需要"客觀"的研究跟探討的態度
第二點，以你的結果數據來看，100倍稀釋太多了
(為什麼會說"你的數據"是因為你的算法)
濃度一旦出現負值，一定是你稀釋過度
這是一個觀念，得到負值時要注意
但是，如果以我幫你重新作出來的數據來算的話結果如下
Sample Av.OD Conc.
A 0.1005 5.621660135
B 0.0691 3.384396152
就都是正值啦!!
看起來雖然有數據好像可以使用，但是因為你只有做一個稀釋
這樣的數據並不可靠，你應該做個其他稀釋倍數然後取平均值
例如：1/20，1/30，1/50等等
(建議不要做連續稀釋，要分開稀釋不同倍數)
另外，B樣品吸光值由於不落在我做出來區線的吸光值內
也就是說我的曲線吸光值可用區在：0.71155~0.0833
所以不能保證B樣品的濃度可信任，總言之：
我算出來的結果，A樣品的濃度可信度比B樣品高
: 1.想請問因為我IP完後，濃度反而低於IP前，是不是我那一步錯誤，
: 這樣正常嗎？
做IP濃度變低是正常的
畢竟妳去除了一些你不要的蛋白質
加上沉澱再回溶的步驟一定也會有所損失
除非你有做很高倍的濃縮，不然IP只是幫你做類似純化的步驟
: 2.bradford assay測的濃度可以在低嗎？我想建一條standard，濃度到0.0625mg/ml以下
: ，我剛抽出來的protein濃度太稀了，因為這是很重要的sample，又有點趕時間
standard curve的建議很重要
但是如果你的樣品濃度太低我則建議不要稀釋樣品去測
如果可以用BCA就用，個人認為效果比bradford來的精準
另外濃度1對於BCA而言並不會飽和，反倒是濃度2才有機會過飽和
: 3.超級笨問題 先將sample OD帶入趨勢線公式在乘回稀釋倍數，
: 還是先將OD*diluent factor?
假設你的回歸公式為：y=ax+b
且一個稀釋N倍的樣品得到的吸光值為y
則樣品原始濃度為：N[(y-b)/a]
利用這個公式你就可以知道實際濃度N[(y-b)/a] 絕對不等於 (Ny-b)/a
所以說，稀釋倍數是最後再乘回去的
: 感激不盡<(_._)>
我建議最好還是重新作一遍蛋白質定量，別浪費這次抽出來的蛋白質
雖然不敢保證我的想法一定全部正確，但可以互相討論
加油~生技的未來要靠大家一起打拼T_T
想說這是一個很好的例子可以讓初學者學會試誤學習
所以花了一些時間整理這個例子中出現的一些盲點
讓原本整個數據好像完全不能採用的情況多一些參考價值
以便下一次再做同樣實驗時可以知道該如何修改實驗的步驟
原po應該還是初學者吧~可以多跟實驗室的學長姐們討論唷^O^
※ 編輯: sharkcell 來自: 118.160.233.103 (10/11 03:21)
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