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sds page配方原理 在 Re: [求救] 請教Western blot的問題- 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
※ 引述《soceress (贏了世界又如何)》之銘言:
: 1.page的配方與running buffer,transfer buffer的關係
: 以前的實驗室的gel用的是molecular cloning裡的配方
: (30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..這是下膠)
: running buffer:含SDS的Tris-Glycine
: transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20%
: 現在這個實驗室用的是
: 30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED
: running buffer:含SDS的Tris-Tricine
: transfer buffer:不含SDS,其餘同上
: 膠的配方主要差在SDS和glycerol
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
主要不是差在那兩種喔~
glycerol只是要增加SDS gel的density
主要是差在running buffer的Tris-Glycine及Tris-Tricine
這個差很多!!!
另外 你確定running buffer含有Tris-Glycine的下層膠Tris-HCl PH是8.8嗎?
印象中好像是8.45 你可能要再查查看0.0?
: 請問這兩種膠的用途有什麼不同呢??
Tricine的 適合用來跑小分子蛋白 resolution佳
視膠濃度的不同 小到2kDa也可以明顯區分出來
一般的SDS PAGE比較沒辦法跑那麼仔細
原理的話就要自己去查查看嚕
: 如果上面的膠配上下面的transfer buffer會不會transfer效率變差??
: 如果上面的膠配上下面的running buffer會不會有問題?? (比方說膠過燙)
: 我要跑的是60~70KD的蛋白質
一般Tricine-SDS-PAGE 有分Anode及Cathode buffer PH分別是8.9及8.25
混著跑... 我也不知道會不會有問題
剩下的問題有勞其他人補充啦~
: 2.transfer的條件如果改變會影響data趨勢嗎??
: 用含SDS與不含SDS的transfer buffer,趨勢會不同嗎??
: 目前學姐們有三種條件(大家用的都不一樣^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白質
: a. 120V transfer 1.5hr
: b. 100V transfer 1.5hr
: c. 50V transfer 4hr
: 自己是覺得應該不會改變趨勢...
: 我一直習慣用b,做出來和一年前剛到新實驗室用a的結果相反......n=4,三重覆
: 於是試著用c,趨勢和b一樣
: 3.同一個sample同時load跑四片
: 染了同一個抗體,理論上4片的target protein都可以染得很清楚(這是已經確定的)
: 結果固定某個檢體,兩片有(明顯),兩片沒有(定量結果為0)
: 聽別人說可能是power supply在transfer過程中短路
: 還有沒有別的可能呢??
: 感謝各位耐心看完~~~
: 先謝謝大家的幫忙~~
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